Tugas 3 : Pemeriksaan Protein

Protein, yang berarti “pertama” atau “utama” merupakan makromolekul yang paling berlimpah didalam sel dan menyusun lebih dari setengah  berat kering pada hampir semua organisme. Asam amino merupakan unit struktur protein. Struktur protein ini terdiri dari polipeptida yang mempunyai rantai yang amat panjang, tersusun atas banyak unit asam amino.

Protein adalah banyaknya residu asam amino lebih besar dari sekitar 100 peptida (Wilbraham, 1992).Dengan pengertian lain protein adalah senyawa polipeptida yang dihasilkan dari polimerisasi asam-asam amino. Jumlah molekul asam amino yang menyusun satu molekul protein berkisar dari 50-1000 unit. Struktur molekul protein tersusun  dari asam-asam amino yang bergabung satu sama lain melalui ikatan peptida.

Indonesia merupakan negara produsen tempe terbesar di dunia dan menjadi pasar kedelai terbesar di Asia. Sebanyak 50% dari konsumsi kedelai Indonesia diperoleh dalam bentuk tempe. Konsumsi tempe rata - rata pertahun di Indonesia saat ini sekitar 6,45 kg/orang.

Sebagai sumber bahan pangan,tempe merupakan salah satu makanan pokok yang dibutuhkan oleh tubuh. Tempe merupakan makanan sumber protein, serat pangan, kalsium, vitamin B dan zat besi.  Tempe merupakan makanan yang terbuat dari kacang kedelai yang difermentasi. Masyarakat luas menjadikan tempe sebagai sumber protein nabati, selain itu harganya juga murah.

Protein kedelai mengandung 18 asam amino, yaitu 9 jenis asam amino esensial dan 9 jenis asam amino nonesensial. Asam amino esensial meliputi sistin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenil alanin, treonin, triptofan dan valin. Asam amino nonesensial meliputi alanin, glisin, arginin, histidin, prolin, tirosin, asam aspartat dan asam glutamat. 

kadar protein pada tempe cukup tinggi yaitu 41,5 % dan telah memenuhi syarat mutu tempe kedelai yaitu minimal 20% (b/b). Tempe juga memiliki kandungan air yang cukup tinggi yaitu 61,2% dan kandungan karbohidratnya sebesar 29,6%. Menurut Standar Nasional Indonesia 01-3144 - 1992, tempe kedelai adalah produk makanan hasil fermentasi biji kedelai oleh kapang tertentu, berbentuk padatan kompak dan berbau khas serta berwarna putih atau sedikit keabu - abuan.

A.    CIRI DAN JENIS PROTEIN

1.      Ciri Protein :

a)   Berat moleklnya besar, ribuan sampai jutaan, sehingga  protein tergolong ke dalam suatu makromolekul.

b)   Umumnya terdiri atas 20 asam amino. Asam amino tersebut dapat membantuk suatu ikatan peptida secara kovalen. Ikatan peptida ini dihasilkan dari ikatan yang dibentuk oleh beberapa asam amino. Ikatan ini terjadi antara gugus α-karboksil dari satu asam amino dengan gugus α-amino dari asam amino yang lainnya.

c)    Terdapatnya ikatan kimia lain, yang menyebabkan terbentuknya lengkungan-lengkungan rantai polipeptida menjadi stuktur tiga dimensi protein. Contohnya seperti ikatan hidrogen, ikatan Van Der Waals, dan ikatan hidrofob (ikatan polar).

d)   Stukturnya tidak stabil terhadap beberapa faktor seperti pH, radiasi , temperatur, dan medium pelarut organik. pH yang sangat tinggi (asam atau basa), radiasi yang sangat besar, dan suhu yang sangat tinggi dapat merusak struktur dari protein tersebut sehingga menyebabkan protein tersebut tidak bermanfaat lagi.

e)   Umumnya reaktif dan sangat spesifik.

Hal tersebut  disebabkan oleh adanya gugus samping yang sangat reaktif dan memiliki susunan yang khas pada struktur makromolekunya. Gugus samping yang terikat pada protein seperti gugus kation, anion, hidroksil aromatik, amina, amida, tiol, dan gugus heterosiklik. Asam amino dapat diklasifikasikan ke dalam 4 golongan yaitu asam amino tak mengutub (non polar), asam amino mengutub (polar) tak bermuatan, asam amino bermuatan positif, dan asam amino bermuatan negatif. Rumus umum dari asam amino yaitu :

2.      Jenis – jenis Protein

a)      Kolagen

protein struktur yang diperlukan untuk membentuk kulit, tulang dan ikatan tisu.

b)      Antibodi

protein sistem pertahanan yang melindungi badan daripada serangan penyakit.

c)      Dismutase superoxide

 protein yang membersihkan darah kita.

d)     Ovulbumin

protein simpanan yang memelihara badan.

e)      Hemoglobin

protein yang berfungsi sebagai pembawa oksigen

f)       Toksin

protein racun yang digunakan untuk membunuh kuman.

g)      Insulin protein

hormon yang mengawal arus glukosa dalam darah.

h)      Tripsin

protein yang mencernakan makanan protein.

SIFAT LARUTAN PROTEIN

      Dalam larutan protein bersifat asam basa. sebagian besar sifat tersebut ditentukan oleh gugus R asam aminonya yang dapat berionisasi. Gugus NH2 dan COOH yang terdapat pada kedua ujung rantai polipeptida sedikit sekali menunjang sifat asam-basa protein tersebut. Karena perbedaan macam protein ditentukan oleh urutan asam amino dan konformasi polipeptidanya, maka kemungkinan ionisasi gugus R itu dipengaruhi oleh gugus tetangganya.

      Seperti pada asam amoni bebas, protein juga mempunyai titik isoelektrik, yaitu pada pH yang menunjukkan jumlah muatan positif dan negatif sama dalam protein itu, sehingga pada keadaan ini daya larut protein minimum. Pada pH ini protein tidak akan bergerak bila diletakkan dalam medan listrik, pH isoelektriknya ditentukan oleh jumlah dan pK gugus R yang berionisasi. Dalam larutan yang pH nya diatas pH isoelektrik. Protein bermuatan negatif dan kanan bergerak ke anoda, pada pH sebaliknya protein bergerak ke katoda.

 

PEMISAHAN PROTEIN

  Pemisahan protein dari campuran yang terdiri dari atas berbagai macam sifat asam-basa, umuran dan bentuk protein, dapat dilakukan dengan cara eletroforesis, kromatografi, pengendapan dan perbedaan kelarutannya.

o   Elektroforesis

Cara ini didasarkan pada kecepatan bergerak yang berbeda-beda dari protein dalam medan listrik, pada pH tertentu. Cara in pertama kali dilakukan oleh Arne Tiselius pada tahun 1973.

o   Kromatografi

Penentuan dan pemisahan campuran protein dengan cara kromatografi dilakukan berdasarkan prinsip yang sama seperti untuk pemisahan dan analisa asam amino.

o   Pengendapan protein sebagai garam

Sebagian besar protein dapat diendapkan dari larutan air dengan penambahan asam tertentu, seperti misalnya, asam triklorasetat dan asam perklorat. Penambahan asam ini menyebabkan terbentuknya garam protein yang tidak larut. Zat pengendap lainnya adalah asam tungstat, fototungstat, dan metafosat. Protein juga dapat diendapkan dengan kation tertentu seperti Zn2+ dan Pb2+.

o   Pengendapan dengan cara perbedaan kelrutan

Berbagai protein globular mempunyai daya kelarutan yang berbeda di dalam air. Variabel yang mempengaruhi kelarutan ini adalah pH, kekuatan ion, sifat dielketrik pelarut dan temperatur.

Pemisahan protein dari campuran dengan pengaturan pH didasarkan pada harga pH isoelektrik yang berbeda-beda untuk tiap macam protein. Pada umumnya molekul protein mempunyai daya kelarutan minimum pada pH isoelektriknya. Pada Ph isoelektriknya bebrapa protein akan mengendap dari larutan, sehingga dengan cara pengaturan pH larutan, masing-masing protein dalam campuran dapat dipisahkan satu dari yang lainnya dengan teknik yang disebut pengendapan isoelektrik.

D.    DENATURASI PROTEIN

Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tertier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovelen. Karena itu, denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hydrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan aterbukanya lipatan atau wiru molekul protein (Winarno, 1992).

Protein yang terdenaturasi akan berkurang kelarutannya. Lapisan molekul bagian dalam yang ersifat hidrofobik akan keluar sedangkan bagian hidrofilik akan terlipat ke dalam. Pelipatan atau pembakikkan akan terjadi bila protein mendekati pH isoelektris lalu protein akan menggumpal dan mengendap. Viskositas akan bertambah karena molekul mengembang menjadi asimetrik, sudut putaran optis larutan protein juga akan meningkat (Winarno, 1992).

            Denaturasi protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Sejak diketahui reaksi denaturasi tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan peptida, dimana struktur primer protein tetap sama setelah proses denaturasi. Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur sekunder dan tersier protein. Pada struktur protein tersier terdapat empat jenis interaksi yang membentuk ikatan pada rantai samping seperti; ikatan hidrogen, jembatan garam, ikatan disulfida dan interaksi hidrofobik non polar, yang kemungkinan mengalami gangguan. Denaturasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi protein (Ophart, C.E., 2003).

                  Denaturasi protein dapat terjadi karena panas. Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar.

Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Protein telur mengalami denaturasi dan terkoagulasi selama pemasakan.

Beberapa makanan dimasak untuk mendenaturasi protein yang dikandung supaya memudahkan enzim pencernaan dalam mencerna protein tersebut.Pemanasan akan membuat protein bahan terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida. Proses ini biasanya berlangsung pada kisaran suhu yang sempit (Ophart, C.E., 2003).

E.     FUNGSI BIOLOGI PROTEIN

o   Enzim

            Protein yang paling bervariasi dan mempunyai kekhususan tinggi adalah protein yang mempunyai aktivitas katalisa, yakni enzim. Hamper semua reaksi kimia biomolekul organic di dalam sel dikatalisa oleh enzim. Lebih dari 2000 jenis enzim, masing-masing dapat mengkatalisa reaksi kimia yang berbeda, telah ditemukan di dalam berbagai bentuk kehidupan.

o   Protein Transport

 Protein transport di dalam plasma darah mengikat dan membawa molekul atau ion spesifik dari satu organ ke organ lain Disini oksigen dilepaskan untuk melangsungkan oksidasi nutrient yang menghasilkan energi. Plasma darah mengandung lipoprotein, yang membawa lipid dari hati ke organ yang lain. Protein transport lain terdapat di dalam membrane sel dan menyesuaikan strukturnya untuk mengikat dan membawa glukosa, asam amino, dan nutrient lain membrane menuju ke dalam sel.

o   Protein Nutrien dan Penyimpan

            Biji berbagai tumbuhan menyimpan protein nutrient yang dibutuhkan untuk pertumbuhan embrio tanaman. Terutama, contoh yang telah dikenal adalah protein biji dari gandum, jagung, dan beras. Ovalbumin protein utama putih telur, dan kasein protein utama susu merupakan contoh lain dari protein nutrient. Ferritin jaringan hewan merupakan protein penyimpan besi.

o   Protein Kontraktil atau Motil

            Beberapa protein memberikan kemampuan kepada sel dan organisme untuk berkontraksi, mengubah bentuk, atau bergerak. Aktin dan miosin adalah protein filamen yang berfungsi di dalam sistem kontraktil otot kerangka dan juga di dalam banyak sel bukan otot. Contoh lain adalah tubulin, protein pembentuk mikrotubul. Mikrotubul merupakan komponen penting dari flagella dan silia yang dapat menggerakkan sel.

o   Protein Struktural

            Banyak protein yang berperan sebagai filamen, kabel, atau lembaran penyanggah untuk memberikan struktur biologi kekuatan atau proteksi. Komponen utama dari urat dan tulang rawan adalah protein serabut kolagen, yang mempunyai daya tenggang yang amat tinggi.

o   Protein Pertahanan

            Banyak protein mempertahankan organisme dalam melawan serangan oleh spesies lain atau melindungi organisme tersebut dari luka. Immunoglobulin atau anti-body pada vertebrata adalah protein khusus yang dibuat oleh limposit yang dapat m,engenali dan mengendapakan atau menetralkan serangan bakteri, virus, atau protein asing dari spesies lain. Fibrinogen dan trombin, merupakan protein penggumpal darah yang menjaga kehilangan darah jika sistem pembuluh terluka. Bisa ular, toksin bakteri, dan protein tumbuhan beracun, seperti risin, juga berfungsi di dalam pertahanan tubuh.

o   Protein Pengatur

            Beberapa protein membantu aktivitas seluler. Diantara jenis ini terdapat sejumlah hormone seperti insulin, yang mengatur metabolisme gula dan kekurangannya menyebabkan penyakit diabetes. Hormone pertumbuhan dari pituary dan hormone paratiroid, yang mengatur transport Ca2+ dan fosfat. Protein pengatur lain, yang  disebut repressor mengatur biosintesa enzim oleh sel bakteri.

o   Protein lain

Terdapat banyak protein yang fungsinya agak eksotik dan tidak mudah diklasifikasikan. Monelin, suatu protein tanaman dari afrika yang mempunyai rasa yang amat manis.

Protein dapat dibagi menjadi dua golongan utama berdasarkan bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu; protein globular dan protein serabut. Pada protein globular rantai atau rantai-rantai polipeptida berlipat rapat-rapat menjadi bentuk globular atau bulat yang padat. Protein globular biasanya larut di dalam system larutan  (air) dan segera berdifusi ; hampir semua mempunyai fungsi gerak atau dinamik. Hampir semua enzim merupakan protein globular, seperti protein transport pada darah, anti-bodi, dan protein penyimpan nutrient.

            Protein serabut bersifat tidak larut di dalam air, merupakan molekul serabut panjang, dengan rantai polipeptida yang memanjang pada satu sumbu, dan tidak berlipat menjadi bentuk globular. Hamper semua protein serabut memberikan peranan structural atau pelindung. Protein serabut yang khas adalah α-keratin pada rambut dan wol, fibroin dari sutera dan kolagen dari urat.

o    Protein Imun

Antibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal serta berkombinasi dengan benda asing seperti virus, bakteri dan sel dari organisme lain.

o    Pembangkit dan Pengantar Implus Saraf

Respon sel saraf terhadap rangsangan spesifik diperantarai oleh protein reseptor. Misalnya redopsin adalah protein yng sensitif terhadap cahaya yang ditemukan pada sel batang retina.

I.                   UJI KUALITATIF

1.      Reaksi Millon

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.

CARA KERJA :

2 ml ekstrak kedelai + 1ml HgSO4 (dipanaskankemudian didinginkan) + 1 tetes NaNO2 1% (dipanaskan lagi),  amati perubahan yang terjadi

HASIL  :  Terbentuk endapan merah

2.      Reaksi Xantoprotein

Uji xantoproteat akan menghasilkan warna orange pada reaksi yang menghasilkan turunan benzena dengan penambahan basa. Uji xantoproteat digunakan untuk asam amino yang mengandung inti benzena (Harper 1980).

Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.

CARA KERJA      :

3 ml kedelai  +  1ml HNO3 pekat (dipanaskan kemudian didinginkan) + NaOH pekat

HASIL         :  Pemberian HNO3 dan dipanaskan     = kuning

Setelah diberi NaOH                                  = jingga

3.       Metode Biuret

Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa - senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.

CARA KERJA    :

3 ml ekstrak kacang kedelai + 1ml NaOH 40% (tambahkan tetes demi tetes CuSO4)

HASIL     :  Larutan berwarna ungu

II.                UJI KUANTITATIF

1.      Metode Kjeldahl

Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.

PENETAPAN KADAR :

1)      Timbang 1 g bahan yang telah dihaluskan, masukkan dalam labu Kjeldahl (kalau kandungan protein tinggi, misal kedelai gunakan bahan kurang dari 1 g).

2)      Kemudian ditambahkan 7,5 g kalium sulfat dan 0,35 g raksa (II) oksida dan 15 ml asam sulfat pekat.

3)      Panaskan semua bahan dalam labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan teruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan sudah menjadi jernih. Tambahkan pemanasan kurang lebih 30 menit, matikan pemanasan dan biarkan sampai dingin.

4)      Selanjutnya tambahkan 100 ml aquadest dalam labu Kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, tambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya tambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah didinginkan dalam lemari es.

5)      Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Panaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapis cairan tercampur, kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih.

6)      Destilasi ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida 0,1N sebanyak 50 ml dan indicator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1N.

7)      Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 ml. Sisa larutan asam klorida 0,1N yang tidak bereaksi dengan destilat dititrasi dengan larutan baku natrium hidroksida 0,1N. Titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi kuning.

DAFTAR PUSTAKA

Ø  Lehninger.1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : Erlangga.

Ø  Pudjiadi, Anna.1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI.

Ø  Arbianto, Purwo.1993. Biokimia Konsep-Konsep Dasar. Bandung : ITB.

Ø  Agustini SKM., M.Si, Ni Putu, 2010.  Penuntun Ilmu Kimia Pangan.

Ø  Wirahadikusumah, Muhammad. 1997. Biokimia: protein, enzim, dan asam. Bandung: ITB. 

Ø  Winarno, F. G., 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : Gramedia

Ø  Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Liberty.

Ø  Wilbraham,Antony c. 1989. Pengantar Kimia Organik dan hayati.Bandung: ITB.